轉自羅氏診斷生命科學公眾號

接頭連接是二代測序文庫制備的重要環(huán)節(jié)，接頭連接效率是影響文庫質量和產量的重要指標之一，它直接影響文庫的多樣性以及低頻突變檢測的準確性。隨著測序儀的不斷迭代，接頭設計也在不斷升級，種類更加多樣化。

接頭結構

接頭作為文庫的組成部分，以illumina接頭為例，一般包括P5/P7、Index以及R1 SP/R2 SP序列，長約60bp左右（不同種類的接頭長度有所不同）。其中P5/P7序列與測序芯片上的P5/P7序列互補，通過錨定將待測片段固定在flow cells上進行橋式PCR擴增；Index又稱為樣本標簽，目的是給文庫加上特定的標簽，用于文庫混合測序時區(qū)分不同的文庫樣本；R1 SP/R2 SP是Read1和Read2測序引物結合的區(qū)域，在dNTP和DNA聚合酶的作用下進行堿基延伸。下圖是接頭的一般結構，呈“Y"字型。

接頭種類

羅氏測序樣本制備解決方案提供兼容illumina儀器的全套KAPA接頭產品組合(圖2)，按照接頭連接方式分為全長接頭和截短接頭。

全長接頭

KAPA UDI Adapters：是一種由P5/P7、96種雙端Index以及R1 SP/R2 SP序列組成的全長接頭，適用于PCR-free文庫制備流程。

截短接頭

截短接頭僅包括R1 SP/R2 SP序列，P5/P7和Index序列需通過引物擴增連入接頭。KAPA HyperPlex Adapters是一套完整的接頭組合產品：

KAPA Universal Adapter：截短型雙端通用接頭，適用于非低頻突變檢測

KAPA Universal UMI Adapter：帶有UMI（Unique Molecular Identifiers）的截短型雙端通用接頭，適用于低頻突變檢測

KAPA UDI Primer Mixes 1-384：搭配兩種KAPA通用短接頭使用，實現達384種Index組合的高通量混樣測序

接頭攻略

雙端標簽設計，有效剔除標簽

錯配序列

多重混樣測序時，有時會發(fā)生接頭標簽序列錯配的問題，進而導致測序數據質量的下降和結果可信度的降低。錯配的風險主要由以下原因引發(fā)：

1）測序儀工作時發(fā)生的標簽跳躍/轉換現象

2）標簽試劑或者樣品間的交叉污染

3）混合樣品在PCR擴增時發(fā)生模板調換

4）測序或數據分析錯誤

KAPA UDI接頭雙端標簽組合在數據分析之前即可過濾掉因標簽錯配而產生的錯誤序列，從而提升變異識別準確性。

UMI標簽設計，提高低頻突變檢測準確性

低頻突變檢測在腫瘤研究，特別是液體活檢研究方面至關重要，但在文庫構建、靶向富集和測序過程中引入的突變會阻礙低頻變異檢測的準確性，UMI標簽可以對原始樣本進行分子標記，有利于后續(xù)在數據分析時對原始樣本進行追蹤和分組，從而對假陽性突變進行校正。

KAPA Universal UMI Adapter采用羅氏專有設計，可防止因UMI序列發(fā)生錯誤導致樣本追蹤錯誤，在性能上表現出更高的雙鏈回收率和更低的錯誤率。

截短型KAPA HyperPlex接頭可以獲得

更高的文庫產量

KAPA HyperPlex接頭擴增效率高，文庫轉化率高，可以在較少的擴增循環(huán)數下得到較高的文庫產量，其文庫產量幾乎是全長接頭的兩倍。

滿足實驗所需文庫產量的情況下，較少的擴增循環(huán)可以增加文庫多樣性并減少PCR重復序列。

高質量二代測序數據少不了接頭助力，

接頭怎么選你學會了嗎？

MC-CN-02167 有效期至2025年5月18日。